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Esperto Giuseppe Piazzolla
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| BIOTECNOLOGIE IN ENOLOGIA Saccharomyces cerevisiae E’ essenziale conoscere bene la flora dei mosti per una corretta utilizzazione dei ceppi starter nella vinificazione. Il programma si basa sull’assunzione che le caratteristiche dei ceppi debbano essere legate a differenze presenti nel loro GENOMA. L’ottenimento quindi delle mappe del loro fenotipo polipeptidico e la conseguente caratterizzazione biochimica potranno essere di valido aiuto agli operatori nel settore enologico. Il lavoro è effettuato avvalendosi, sia di tecniche elettroforetiche (2D-PAGE) accoppiate ad analisi compiuterizzata, sia di tecniche biotecnologiche (preparazioni di antisieri e radioimmunoprecipitazioni, sequenziazione, tecniche cDNA, ecc.) per la caratterizzazione delle specie proteiche depositarie della capacità di influenzare la vinificazione. Messaggeri intracellulari nelle piastrine La funzione delle piastrine è inibita notevolmente da agenti che aumentano i livelli intracellulari di cAMP. L’inibizione della funzione piastrinica da parte di cAMP è associata con l’attivazione di PKA e successiva fosforilazione di almeno quattro proteine, la proteina G a basso peso molecolare rap1b, la subunità b di GPIb, la proteina legante l’actina e la proteina VASP. Queste proteine condividono anche la caratteristica di associarsi al citoscheletro quando le piastrine sono stimolate con trombina o altri agonisti. Inoltre, sempre nelle piastrine, cAMP può essere un regolatore della via di trasduzione del segnale regolata dalle MAP chinasi attraverso un’interazione di una di queste proteine, rap1b, con componenti della cascata delle MAP chinasi, compresa la raf-1 chinasi. RGL2, una proteina recentemente isolata da noi con il metodo del doppio ibrido, è un effettore per rap1b e sembra essere in grado di accoppiare il segnale di rap1b con quello regolato da altre proteine che svolgono una funzione importante in processi di formazione del citoscheletro (rho e rac). Allo scopo di chiarire il ruolo svolto da RGL2 nella regolazione della via del segnale regolata da rap1b ci proponiamo di : 1) definire le sequenze critiche per l’interazione con rap1b e altre proteine della superfamiglia ras; 2) esaminare il ruolo potenziale di RGL2 nella via del segnale regolata dalle MAP chinasi. Studio dell'espressione genica di ceppi di Saccharomyces cerevisiae impiegati nella vinificazione. Il Saccharomyces cerevisiae svolge un ruolo chiave nel processo di fermentazione alcolica. Alla capacità fermentativa di tale lievito sono legate alcune problematiche che interessano la vinificazione, principalmente l'avvio e la possibilità di rallentamenti o blocchi causati dall'instaurarsi di condizioni sfavorevoli quali carenze nutrizionali, carenza di ossigeno, inibizione da substrato, tossicità da etanolo, shock termico. Gli obbiettivi di questa linea di ricerca sono i seguenti: 1) selezionare uno o più ceppi di lievito in grado di portare a termine la fermentazione anche in condizioni di stress chimico fisico e biologico e capaci di incidere in maniera positiva sulle caratteristiche qualitative del vino; 2) definire i meccanismi cellulari di risposta agli stress ambientali attraverso l'identificazione della natura e delle funzioni biochimiche delle proteine sintetizzate alle quali è legata la capacità di superare tali condizioni critiche. Per raggiungere tali obbiettivi verrà analizzato il corredo proteico dei ceppi di S.cerevisiae durante le varie fasi della fermentazione ed in differenti condizioni nutrizionali impiegando tecniche di elettroforesi bidimensionale accoppiate con tecniche di immunoblotting e microsequencing. Strumentazione Incubatori per lieviti e batteri, termociclizzatore, apparecchiatura per elettroforesi del DNA su gel di poliacrilammide e gel di agarosio, gel-dryer, centrifughe e microcentrifughe, apparecchiatura per elettroforesi mono e bidimensionale di proteine, apparecchiatura per immunoblotting, sequenziatore di proteine, HPLC. Tecnologie Tecnica del doppio ibrido, tecniche di clonaggio del DNA, sequenziazione del DNA, amplificazione del DNA tramite PCR, analisi del DNA tramite elettroforesi su gel di agarosio. Uso di ceppi di lievito e batterio come cellule ospiti per clonaggio del DNA ed espressione di proteine ricombinanti. Elettroforesi mono e bidimensionale di proteine, immunoblotting, microsequenziamento di proteine. Giuseppe Piazzolla |